Muenchen, im September 2004

-  Mykoplasmen in der Zellkultur ?

Kontaminationen sind unsichtbar, aber nicht ungefaehrlich

 

Wir werden immer wieder gefragt:

 

Was sind Mykoplasmen?

Wie erkenne ich sie?

Wie schaedigen sie meine Kulturen und wie erkenne ich diese Schaeden?

Kann ich bei Befall meine Kulturen retten oder nicht?

 

Fragen, die sich jeder, der mit Zellkulturen arbeitet, schon selbst gestellt hat.

 

Sind Sie sich sicher, keine Kontamination in Ihren Kulturen zu haben?

Vielleicht denken Sie sich: Lieber keine schlafenden Hunde wecken, bis jetzt ist doch alles gut gegangen... , oder?

 

Wir wollen Ihnen dabei zur Seite stehen und zugleich ein gutes Angebot zur Testung Ihrer Zellkultur auf Mykoplasmen machen, doch zunaechst die am haeufigsten gestellten Fragen unserer Kunden beantworten:

 

Was sind Mykoplasmen ?

 

Mykoplasmen sind die kleinsten Prokaryoten, die man bisher gut charakterisiert hat. Sie sind ca. 0.2 bis 2,0 Mikrometer kleine und sehr ungewoehnliche Mikroorganismen. Sie haben im Gegensatz zu ihren Verwandten (Bakterien, Bazillen) keine rigide Zellwand und es fehlen intrazellulaere Membranen. Gemeinsam haben sie mit den meisten Bakterien ein relativ kleines Genom und die Vermehrung durch einfache Zweiteilung, wobei sie erheblich langsamer wachsen als Bakterien. Fuer Prokaryoten ist es sehr ungewoehnlich, dass Mykoplasmen fuer ihre Membran bzw. fuer das Wachstum Cholesterin benoetigen. Ca. 20 Mykoplasmenstaemme sind fuer ca. 95 % aller Infektionen unserer Zellkulturen verantwortlich (fuer die Herkunft ist zu nahezu gleichen Anteilen der Mensch, das Rind und das Schwein verantwortlich).

 

Zellkulturen zeigen optisch kaum Veraenderungen, wenn sie mit Mykoplasmen befallen sind.

Warum werden die Mykoplasmen trotzdem als gefaehrlich eingestuft??

 

Mykoplasmen richten anfangs keine erkennbaren Schaeden an. Sofern Sie Ihre Zelllinie gut kennen oder durch eine Wachstumskurve charakterisiert haben, werden Sie als erstes beobachten, dass bei einer moeglichen Infektion ihre Kulturen immer etwas langsamer wachsen. Lichtmikroskopisch sichtbar sind Infektionen mit Mykoplasmen leider nicht, da die Prokaryoten unter der Aufloesungsgrenze des Lichtmikroskops liegen, die bei ca. 260 nm liegt, also 0,26 µm. Es ist weder im Medium eine Truebung erkennbar, noch ein  augenfaelliger pH-Umschlag ins saure Milieu (Medium wuerde sich gelb verfaerben), noch dramatische morphologische Veraenderungen an den Zellen.

Aber: Mykoplasmen greifen vielfaeltig in den Stoffwechsel der befallenen Zellen ein und veraendern damit das Wachstum und letztlich doch die Eigenschaften der Zellen. So verursachen sie meist eine fortschreitende Verarmung von basischen Aminosaeuren im Zellkulturmedium, was zu einer Destabilisierung der Chromosomen fuehrt. Die Folgen sind Mikrokernabspaltungen, Anfaelligkeit der Zellen fuer Mutation und Transformation und vorzeitiges Ausloesen der Apoptose, dem natuerlich induzierten Zelltod. Mykoplasmen koennen auch Antigenpraesentationen verhindern und Signaltransduktion ausloesen. Zusaetzlich koennen sie Rezeptorfunktionen der Zellmembran stoeren und in die Zelle eindringen. All dies geht langsam und schleichend vor sich.

Fazit: Mykoplasmen sind immer und ueberall und machen, bedingt durch unsterile Materialien oder unsaubere Arbeitsweise, auch vor Zellkulturen nicht halt. Und: Nichtwissen schuetzt vor Schaden nicht! Jedes Labor sollte routinemaessig Tests ihrer Kulturen durchfuehren, um gegebenenfalls bei einer Infektion groesseren Befall im Zellkulturlabor zu verhindern (die Wahrscheinlichkeit, dass Mykoplasmen auf andere, bisher nicht kontaminierte Kulturen ueberspringen, ist sehr gross).

 

Die  2 Methoden zur Mykoplasmenerkennung, die wir anbieten, sind:

 

DAPI-Faerbung / Fluoreszenzmikroskopie:

Dieses System hat sich ueber lange Zeit bewaehrt und wird in unserem Institut seit ueber 20 Jahren angewandt. Die indirekte DNA-Faerbemethode kann mit allen Zellkulturen, ob adhaerent oder in Suspension wachsend, oder in deren Ueberstaenden angesetzt werden. Dabei wird die Faehigkeit von bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen (DAPI oder Hoechst 3352) mit der DNA zu interkalieren, ausgenutzt: Der Farbstoff schiebt sich in das riesig lange Makromolekuel zwischen die Nukleotidpaarungen und ruft dort nach UV- Bestrahlung im Mikroskop eine starke, gut erkennbare Fluoreszenz hervor. In Mykoplasmen freien Proben wird nur der Kern der Zellen angefaerbt, waehrend im Zytoplasma und ausserhalb der Zellen keinerlei Fluoreszenz zu sehen ist. In kontaminierten Proben bilden die angefaerbten, mykoplasmatischen DNA-Ringe indirekt den Zellkoerper punktuell oder als Schleier ab, da die Mykoplasmen an ihm haften.  Dieser Test erfordert zwar einige Sorgfalt und Zeit (Inkubationszeit von Traegerzellen mit dem zu testenden Ueberstand von ca. 2-4 Tagen) und neben einem guten Fluoreszenzmikroskop auch einige Erfahrung, ist aber dann empfindlich und aussagekraeftig genug, um eine erfolgte Kontamination sicher zu erkennen oder auszuschliessen.

 

Jedoch wer verlaesst sich schon auf nur einen Test, auch wenn er noch so gut ist?

Einfach und sehr sensitiv ist eine neue Methode, die wir evaluiert haben: der sog. Mycoalert -Test der Fa. Cambrex (fuer die Zellkulturprofis: dies ist die ehemalige Firma Biowhitaker) - der schnellste Test bei der Mykoplasmenerkennung, zudem einfach zu handhaben und sicher in der Aussage.

Ausgangspunkt bei diesem Test ist die Tatsache, dass sich in den Mykoplasmen spezielle Enzyme befinden, die in unseren Saeugerzellen entweder quantitativ nur eine geringe Rolle spielen oder ?berhaupt nicht vorkommen. Die lebenden Mykoplasmen werden bei diesem Test mittels eines speziellen Reagenzes lysiert: Somit werden die spezifischen Enzyme freigesetzt. Diese reagieren mit einem zugesetzten Substrat, welches die Umsetzung von ADP zu ATP katalysiert. Im Luminometer werden die Lichtblitze ausgewertet, die bei der Umwandlung zu ATP mittels der bekannten Lumineszenzerscheinung (Luziferin/Luziferase-System) entstehen. Misst man bei diesem Verfahren den Unterschied der Lumineszenz vor und nach Zugabe des Agens, so kann leicht aus dem Verhaeltnis der beiden Messungen auf eine Kontamination geschlossen werden. Das Verfahren ist empfindlich genug, um alle Mykoplasmen-Staemme mit einer sehr guten Empfindlichkeit (< 100 CFU) zu erkennen. Zudem ist der  Test schnell durchzufuehren, sodass ein Ergebnis schon innerhalb von 20 min vorliegt. Falsch positive Ergebnisse sind nahezu ausgeschlossen: Es sei denn sie haben eine spezielle Bakterieninfektion (z.B. bakterielle L-Formen), dann sollten Sie die Kulturen sowieso vernichten. Einziger Schwachpunkt ist das nicht in allen Labors vorhandene Luminometer, doch auch ein Szintillationszaehler eignet sich dafuer, sofern man den Koinzidenzmodus ausschalten kann.

 

Die weiteren Tests:

 

PCR:

Als angeblich sensitivste Methode ist die Polymerasekettenreaktion, kurz PCR, zu nennen, die mittlerweile in jedem molekularbiologischen Labor fast Standard ist. Sie ist, wenn man mit dieser Methode vertraut ist, ein durchaus gutes und fuer alle Mykoplasmenstaemme anwendbares Verfahren, auch wenn die frueher angegebene hohe Sensitivitaet sich nicht ganz bestaetigen liess. Probleme gibt es bei falsch positiven Resultaten, wenn man nicht mit der noetigen Sorgfalt den Test durchfuehrt, da auch der gesunde Mensch selbst Mykoplasmen vor allem im Rachenraum mit sich traegt. Weiterhin sind die Kosten und die Dauer ein Problem, selbst mit modernsten Geraeten braucht man/frau einen ganzen Tag, um eine Aussage zu bekommen.

 Fazit: Teuer, aufwaendig, mittelpraechtig in der Empfindlichkeit, jedoch fuer gut ausgebildete Molekularbiologen, die den Blick ins Mikroskop scheuen, zu empfehlen.

 

Die Direktkultivierung

Als zweite, relativ empfindliche Methode ist die direkte Kultivierung in einem besonderen Agar, dem Mykoplasmenagar, zu erwaehnen. Hierbei wird in einem komplizierten Verfahren zunaechst eine anaerobe Direktkultur des Zellkulturueberstandes vorgenommen, wobei eine positive Kontrolle dabei mit angesetzt werden muss (meist M. pneumoniae). Jedoch dauert es mindestens 14 Tage bis drei Wochen, bis ein Ergebnis sichtbar ist und manche, vor allem die vom Menschen stammenden Staemme, sind nicht kultivierbar, d.h. selbst ein in einem anderen Test als positiv erkennbare Kontamination kann ein negatives Ergebnis bringen. Zur Empfindlichkeitssteigerung gibt es bei diesem Verfahren noch eine Anreicherungsvariante, die mit einem speziellen Anreicherungsmedium zunaechst fuer mindestens zwei Wochen unter aeroben Bedingungen arbeitet. Anschliessend wird die Probe wieder auf den Mykoplasmenagar unter anaeroben Bedingungen fuer weitere 14 Tage inkubiert. Auch hier sind wiederum bestimmte Staemme als Positivkontrollen vorgesehen.

Man sieht unschwer, dies ist selbst fuer den ausgefuchstesten Mikrobiologen eine Herausforderung, von der Notwendigkeit, sich lebende Mykoplasmen ins Labor zu holen, ganz zu schweigen. Ferner ist das Protokoll der Kultivierung zwar aus der Laborroutine heraus reproduzierbar, ganz einsichtig und konsequent ist das Verfahren keineswegs, da die auf den Zellen vorhandenen und auch wachsenden Mykoplasmen durchaus unter aeroben Bedingungen anscheinend praechtig gedeihen, auch wenn man unterstellt, dass es moeglicherweise fakultativ anaerob wachsende Mykoplasmen in der Zellkultur geben koennte. Und dann kommt noch ein Umstand hinzu (s.o.): Manche Staemme, und darunter sind  gerade die humanen, widersetzen sich dieser Direktmethode und wachsen nicht auf dem Agar. Ein Test, derzwar sehr sensitiv ist (es werden noch weniger als 100  Kolonie bildende Einheiten = CFUs erkannt), jedoch fuer die Praxis und als Routinetest wohl nicht zu empfehlen.

 

Weitere  Tests:

Ein weiterer Test, der angeboten wird, ein sog. ELISA- Test ist auf dem Markt, der mittels monoklonaler Antikoerper gegen Mykoplasmen spezifische DNA- bzw. RNA- Abschnitte eine ganze Reihe von Mykoplasmen erkennt. Jedoch ist er aufwendig und teuer und in der Empfindlichkeit nur durchschnittlich, da er nicht alle Spezies erkennt und deshalb mit Vorsicht zu interpretieren ist.

Ein weiterer Test, der relativ einfach durchzufuehren ist, ist der sog. 6-MPDR- Test. Auch hier ging man von den Mykoplasmen spezifischen Enzymen  aus (ein die Erbsubstanz modifizierendes Enzym, das im Saeugerrepertoire quantitativ nahezu undetektierbar ist, welches die Mycoplasmen aber durchaus besitzen). Dieses Enzym wandelt ein eingesetztes Substrat um, das 6-Methyl-Purin-Desoxyribosid, kurz 6-MPDR genannt. Diese Substrat wird nun mit der Zeit von den Mykoplasmen aufgenommen und zu einem fuer Saeugerzellen zytotoxischem Agens verstoffwechselt. Diese Metabolisierung braucht mindestens 2- 3 Tage, wobei das Agens einfach mit den Zellen inkubiert wird. Je nach Zelllinie zeigt sich dann nach  dieser Zeit der zytopathische Effekt, d.h. die Zellen gehen durch das Stoffwechselendprodukt langsam zu Grunde.

 Leider ist bei aller Einfachheit dieser Test der unempfindlichste.

Ferner empfiehlt sich dabei der Gebrauch von sog. Indikatorzellen: Z.B. die Mauszelllinie 3-T-6 reagiert relativ empfindlich auf das Stoffwechselprodukt, sodass es empfehlenswert ist, nach den drei Tagen Inkubation mit dem Substrat 6-MPDR den Ueberstand abzunehmen und diese Indikatorzelllinie damit  zu fuettern und nach 2-3 Tagen die Reaktion unter dem Mikroskop zu diagnostizieren. Bei aller Einfachheit des Tests benoetigt man (frau) doch nahezu eine Woche, um ein Ergebnis zu bekommen.

Der letzte und bisher aufwendigste Test, der zudem nur mit Radiochemikalien auskommt, ist die spezifische Hybridisierung von sog. DNA- Sonden. Sie sind allesamt auf der Basis Mykoplasmen spezifischer r-RNA aufgebaut, und hybridisieren mit der entsprechenden DNA der Mykoplasmen. Durchaus sensitiv, jedoch noch nicht kommerziell verfuegbar. In einigen Institutionen, wie der Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen  und Zellkulturen (DSM)  wird dieser Test als Serviceleistung angeboten.

 

Unsere Leistungen zum Thema Mykoplasmen:

Wir bieten Ihnen an:

So bieten wir schon seit langem den DAPI- Test als Dienstleistung an und haben den Lumineszenztest neu aufgenommen.

Test Ihrer Zellsuspension oder Ihres Zellkulturueberstandes (Bedarf 5 ml Versand z.B. in Roehrchen, im wattierten Kleinumschlag per Post) mit

?     DAPI-Faerbung / Fluoreszenzmikroskopie (Einzelpreis EURO 79.--/Probe)

?      Mycoalert / Luminometer (Einzelpreis Euro 79.--/Probe)

 

 

Als Paket koennen wir zum unschlagbaren Preis von  Euro 140.-- diese beiden Tests anbieten, hierbei bekommen sie eine gute Aussage und hohe Sicherheit ueber die Mykoplasmen- Freiheit Ihrer Kulturen. Die Prozedur ist einfach und ?berzeugend: Sie schicken uns Ihre Zellen trypsiniert (bei adhaerenten) oder nicht trypsiniert (bei Suspensionszellen) als Suspension (5ml in einem kleinen Zentrifugenroehrchen) zu und nach spaetestens fuenf Tagen haben Sie ein Ergebnis, das Sie ueberzeugen wird. Probieren Sie es aus, Sie werden sehen, es lohnt sich, den Status Ihrer Kulturen bezueglich Mykoplasmen zu kennen.

 

Zu guter Letzt:

 

Was tun, wenn die Kulturen wirklich verseucht sind?

Die erste und beste Reaktion: Fort mit Allem, was mit der verseuchten Zellkultur im weitesten Sinne zusammenhaengt, die verseuchten Kulturen in den Autoklaven und konsequent von Neuem anfangen.

Zweite Moeglichkeit, wenn die Kulturen nicht ersetzbar sind: Rettung durch Einsatz von Antibiotika. Wirklich koennen nur drei Antibiotika helfen: Ciprofloxacin (Ciprobay), Tiamulin und Minocyclin (BM- Cyclin I und II ). Alle anderen Antibiotika sind entweder Nachahmer (so z.B. das Mycoplasma Removal Agent ist nahezu identisch mit Ciprofloxacin) oder andere (wie Gentamycin, Streptomycin und weitere Antibiotika) sind einfach wirkungslos bzw. durch Resistenzentwicklung dazu geworden.

Doch Vorsicht: Eine Garantie nach der Behandlung gibt es auch bei den wirksamsten Mitteln nicht, es kann immer wieder zu Reinfektionen oder gar zu Resistenzen kommen und wenn Sie Ihre Kulturen wirklich dauerhaft kurieren wollen, kommen Sie um eine Klonierung nach der Behandlung nicht herum. Dies ist aufwaendig und nur durch konsequente Kontrollen (siehe oben) zu erreichen.

 

Ich wuensche Ihnen viel Erfolg bei Ihrer Kulturarbeit und moeglichst keine Mykoplasmen!

 

Ihr

Toni Lindl